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    轴承加热器系列

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    刘丽莉┃Bacillus cereus MBL13-U胶原蛋白酶的分离纯化

    发布时间:2019-02-14 00:55

      原标题:刘丽莉┃Bacillus cereus MBL13-U胶原蛋白酶的分离纯化及其降解动力学分析

      摘 要胶原蛋白酶是特异性水解天然胶原蛋白或明胶的酶类。为制备新型的骨胶原蛋白酶并探讨其降解胶原蛋白的能力,通过采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析等分离纯化步骤,从BacilluscereusMBL13-U菌株的粗酶液中分离纯化出一种特异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶(bone-specific collagenase,BSC),对该酶的分子质量、底物特异性和降解能力进行了分析,并构建出其降解牛骨胶原蛋白的动力学模型。结果表明:分离纯化的BSC比活力为5.57×103U/mg,纯化倍数达到42.85倍,分子质量约为52.0 kDa。经特异性分析该酶为骨胶原蛋白酶,且有显著的水解I型胶原蛋白的能力。其水解能力优于其他常用的蛋白酶。构建出该酶降解牛骨胶原蛋白的动力学模型为:降解速率R=(583.813 6E0+1.296 7S0)exp(-0.119 0DH),水解度

      我国的养殖业发展迅速,如何有效利用畜禽屠宰后的副产物,成为近年来的研究热点。利用酶技术对我国来源广泛的畜禽骨资源进行深加工,既解决了大量畜禽骨骼的浪费问题,又带来了一定的经济效益[1-2]。胶原蛋白酶是通过胶原的解螺旋作用降解胶原蛋白却不作用于其他蛋白底物的酶类。胶原蛋白肽是胶原蛋白经降解后所得的小肽混合物,其具有相对分子质量小、易吸收、抗氧化、降血压、增强免疫力等诸多生理活性[3-4]。从来源上,胶原蛋白酶可分为微生物胶原蛋白酶和动物胶原蛋白酶,而微生物源的胶原蛋白酶因其高酶活等优点被广泛采用,如FERREIRA等[5]通过曲霉菌生产胶原酶,并对所产酶分离纯化及酶学特性研究。NAGANO等[6]从枯草芽孢杆菌培养基的上清液中分离胶原酶,研究酶纯化后的特异性。ABFALTER等[7]从蜡状芽孢杆菌ATCC 14579中克隆出胶原酶ColA基因并对其表达机制进行研究。在工业开发中胶原蛋白酶可应用于胶原蛋白分级降解获得胶原多肽,而由于骨骼中主要的蛋白质为胶原蛋白,因此选用专用的胶原蛋白酶进行酶解则具有很高的研究价值。

      蛋白的降解过程是集复杂和多样于一体的过程[8-10],不同的蛋白酶和降解条件都会对蛋白质的降解产生很大的影响,很难在生产应用上掌握和调控蛋白的降解过程。因此,从反应机理出发,推导描述蛋白质降解过程规律的动力学关系,得出动力学参数,建立符合实验数据的实验模型,对于蛋白质降解过程的深入理解有重要意义[11-12]。本研究以课题组筛选的菌种BacilluscereusMBL13-U为出发菌种,将其粗酶液依次采用多种分离纯化步骤,纯化出一种特异降解牛骨胶原蛋白的酶,并对其特性进行了相关分析。同时,参照相关研究[13-15],以米氏方程为基础,针对骨胶原蛋白酶(bone-specifi collagenase,BSC)降解牛骨胶原蛋白的动力学进行探讨,从而构建出降解牛骨胶原蛋白的动力学模型。该项研究为新型胶原蛋白酶源的开发及其未来开发应用奠定了科学理论意义。

      新鲜牛腿骨,洛阳老城区农贸市场; 牛跟腱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白,DEAE琼脂糖凝胶FF,上海源叶生物有限公司;牛血清白蛋白,众一生物公司;葡聚糖凝胶G100,上海蓝季科技;甲醛、HCl、NaOH,洛阳昊化化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

      THZ-130B恒温培养摇床,上海一恒科学仪器有限公司;高速冷冻离心机,湖南湘仪仪器有限公司;紫外分光光度计,上海精密仪器有限公司;BS-100A自动部分收集器、BT-100数显恒流泵、TH-500梯度混合仪,上海青浦沪西仪器厂;电泳仪,北京六一仪器厂。

      新鲜牛骨→除杂→切块(5~6 cm)→高压蒸煮(121 ℃,0.1 kPa)→脱脂、脱钙(0.48% HCl) →水洗→烘干→粉碎(40目筛)→牛骨胶原蛋白[16]

      参照课题组前期实验确定的最佳产酶条件进行培养菌种[17],将B.cereusMBL13-U以4 mL/100mL的接种量接种于pH 6.4的发酵培养基中,在35 ℃,160 r/min的条件下反应46 h,以14 800g离心力,4 ℃高速离心25 min,收集上清液即为BSC的粗酶液M1样。

      向M1样中缓慢加入(NH4)2SO4,使其溶液饱和度达到30%,4 ℃静置8 h后,在离心力为14 800g,4 ℃条件下高速离心25 min,接着向上清液中加入(NH4)2SO4,使其溶液饱和度达到75%,采取同样方法离心,收集沉淀;沉淀用去离子水溶解离心,将上清液移入透析袋内,4 ℃,2~3 h更换一次去离子水,将透析后的去离子水用BaCl2检测,直到检测不出沉淀,透析结束。透析后冷冻干燥得到M2样。然后将M2样溶液用DEAE-Sepharose Fast Flow离子层析柱进行洗脱,洗脱速度为0.8 mL/min,按4 mL/管,定时5 min的速度收集洗脱液,得到M3样[18]。取M3样溶液1 mL加入Sephadex G-100凝胶层析柱进行洗脱,洗脱速度为0.5 mL/min,按2.5 mL/管,5 min的速度收集洗脱液,收集酶活较高的部分,干燥后得到BSC的纯品。

      BSC的分子量及纯度鉴定采用SDS-PAGE垂直电泳法[19]进行分析,本试验选择的分离胶为10%,浓缩胶为5%。

      分别将BSC、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶作用于牛跟腱I型胶原蛋白上,在温度为50 ℃和pH 6.5条件下反应6 h后,沸水浴5 min,冷却后离心取上清液,对其进行水解度测定。

      将BSC分别作用于牛血清白蛋白,牛跟腱I型胶原蛋白、牛跟腱II型胶原蛋白、牛跟腱Ⅲ型胶原蛋白,在温度为50 ℃和pH 6.5条件下反应6 h后,沸水浴5 min,冷却后离心取上清液,分别测其水解度。

      将分离纯化出的BSC作用于牛骨胶原蛋白,研究降解过程中酶添加量(0.12、0.22、0.32、0.42 g/100 mL)和牛骨胶原蛋白添加量(4.14、5.14、6.14、7.14 g/100 mL)对水解度的影响。其中,调节反应液至pH 6.5,将其置于恒温培养摇床中在46 ℃的条件下反应8 h,分别在每隔30 min对应的反应时间下将反应液沸水浴灭酶15 min,以6 570g的离心力离心15 min,得上清液测其水解度。

      通过BSC降解牛骨胶原蛋白中不同BSC添加量和牛骨粉添加量对其水解度的影响,根据各研究学者前期的模型构建,结合本试验的相关参数,推导出符合本研究BSC降解牛骨胶原蛋白过程中蛋白降解动力学的模型,并对该模型进行验证试验,以确保模型的有效性。

      样的洗脱时间为260 min,期间共出现了30~75 min的洗脱峰I、85~150 min的洗脱峰II、170~235 min的洗脱峰Ⅲ3个明显分离的洗脱峰,分别对这3个明显的洗脱峰进行胶原蛋白酶酶活的检测,发现仅在洗脱峰Ⅲ的时间范围内检测出了胶原蛋白酶酶活,证明在170~235 min洗脱时间内分离出的为BSC,为了保证BSC的纯度,收集180~185 min内的洗脱液,此时NaCl的浓度为0.57 mol/L左右,此范围内收集的BSC活达到最高,重复多次试验,收集BSC洗脱液,于真空冷冻干燥箱内干燥得M

      样的洗脱时间为230 min,在整个分离纯化期间共出现了2个完全分离的洗脱峰,洗脱峰I、II出现的时间为40~80 min和120~200 min,分别对洗脱峰I和II中的各管BSC的洗脱液进行酶活检测,结果发现仅在洗脱峰II的时间范围内检测出了胶原蛋白酶酶活,证明在120~200 min的洗脱时间内分离纯化出的为BSC,为了保证BSC的纯度,我们选取155~165 min内的洗脱液进行收集,此范围内收集的BSC酶活达到最高,重复多次试验,收集BSC洗脱液,真空冷冻干燥后的BSC纯品。

      沉淀后BSC中大部分杂质已经除去,再经过2次柱层析的分离纯化后BSC的蛋白质总含量为1.14 mg,总酶活为6.35×103U,比活力为5.57×103U/mg,纯化倍数达到42.85倍,纯化效果良好。表1BSC的分离纯化结果

      样条带较多,证明此时的酶液中含有较多的杂蛋白质;M3样仅有几条明显的条带,表明M3样大部分的杂蛋白被分离除去;当M

      样经Sephadex G-100凝胶层析纯化过后,只有1条明显的条带,证明此时分离纯化出的BSC已达到了电泳纯的程度,为BSC纯酶。目前有关胶原蛋白酶的研究,如李星硕等

      纯化的胶原酶的分子质量为100.0 kDa,龚福明等[25]从枯草芽孢杆菌中提取的胶原蛋白酶分子质量为33.0 kDa,刘丽莉等[2]从蜡样芽孢杆菌中的得到的蛋白酶分子质量约为38.0 kDa,而本实验分离纯化的BSC的分子质量约为52.0 kDa,可以认定其为一种新型的蛋白酶。Mark—标准蛋白;1—Sephadex G-100凝胶层析后纯化的BSC; 2—DEAE -Sepharose Fast Flow阴离子层析后分离的BSC; 3—(NH4)2SO4

      2.5.1 不同BSC添加量和牛骨胶原蛋白添加量对降解过程中水解度的影响针对不同的酶添加量和底物浓度,测定牛骨胶原蛋白的水解度变化,结果见图7。

      由图7可知,随着BSC和骨胶原蛋白添加量的不断上升,水解度也逐渐提高。同时也可看出,在反应初期,两者的降解反应速率随着时间的延长均呈现出先迅速增加后变缓,最终基本保持不变。这是因为反应初期随着时间的不断延长,BSC与骨胶原蛋白充分结合反应,加快了反应速率,但是当到达一定的反应时间后,BSC与骨胶原蛋白反应基本完成,反应体系达到饱和,导致反应后期反应速率基本保持不变。

      ,他们所建立的米氏方程可以有效地描述降解反应过程的动力学,即反应用的酶(

      (1)结合前期的许多研究学者[10,13]的数学推导,BSC降解骨胶原蛋白过程的动力学模型为:

      为牛骨胶原蛋白添加量,g/100 mL;K2为降解反应速率常数项,h-1;Kd为BSC失活反应速率常数项,h-1;Km为米式常数。令α=

      (6)其中:R为降解速率。2.5.3 BSC降解牛骨胶原蛋白的动力学各参数的确定将图7中不同的BSC和牛骨胶原蛋白添加量和不同降解时间内水解度的变化分别带入式(5),利用Origin 8.5分别对其进行非线

      kineticparametersofthedegradationprocess由表3可以得出,在恒温条件下,随着BSC添加量的逐渐增加,α呈现逐步增加的趋势,随着骨胶原蛋白添加量的逐渐增加,α反而逐步降低,这恰好与公式(3)相对应,α与BSC添加量成正比,与骨胶原蛋白添加量成反比,同时,在表3中可以看出,β并不随BSC添加量和牛骨胶原蛋白添加量的变化而变化,基本在0.119 0左右的范围内,由公式(4)中可以看出,在设定相同温度反应体系的前提下,

      α与BSC添加量和牛骨胶原蛋白添加量的比值呈线性关系,采用Origin 8.5对表3中E0/S0,α的结果进行线性拟合,得出结果为:α

      (10)其中:K4为BSC降解牛骨胶原蛋白过程中BSC失活常数(h-1)。将式(7)带入式(3)和式(4)得:

      的乘积与BSC添加量和牛骨胶原蛋白添加量的比值呈线性关系,采用Origin 8.5对表3中E0/S

      2.5.4 BSC降解牛骨胶原蛋白的动力学模型验证为了验证本模型,在反应温度46 ℃、牛骨胶原蛋白添加量5.14 g/100 mL、酶添加量0.42 g/100 mL、pH 6.5的条件下分别测得不同反应时间的水解度变化。如图8所示,与模型拟合值基本吻合,相对误差为0.45%,表明此模型能较好地描述牛骨胶原蛋白的降解过程,具有实际的应用价值。

      collagen; purification; bone specific collagenase(BSC); kinetics; degradation

      基金项目:国家自然科学基金(31401622);公益性行业(农业)科研专项(201303084);河南省重点攻关项目(0);河南省教育厅自然科学研究项目(13A550255);河南省重大专项(0)

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